免疫荧光必备&抗淬灭剂推荐

如果荧光染色的目标分子丰度比较低或者样本在强激发光下长时间放置，很容易出现明显的光漂白作用，即荧光淬灭作用。Life Technologies公司专门开发了 ProLong 和 SlowFade 两个系列抵抗荧光信号淬灭的试剂。其主要原理是可以有效避免荧光染色后的固定细胞或组织等样品不被氧化，从而防止荧光淬灭导致的荧光信号减弱现象。

ProLong系列抗淬灭试剂则能提供给样品荧光信号数月的保护，只要将样品封片放置在干燥避光的环境下，荧光信号可以在一年甚至更长时间内不减弱或是淬灭。但该系列产品在处理样品以后必须室温避光放置 24 小时才能进行观察和图象记录，否则其荧光颜色会因折光律的改变而与实际颜色有所不同（图 1）。

SlowFade系列抗淬灭试剂处理样品后可以直接进行观察与图象记录，其可保证荧光信号在 3 到 4周内不明显减弱，如果适当封片还可以延长更多时间。

抗淬灭剂使用简便，只需加 1 滴至玻片即可。

Figure 1. ProLong® Gold 在凝固的过程中折射率不断增加

Figure 2. ProLong® Gold (图 A) and SlowFade® Gold (图 B)
抗淬灭剂有效防止光漂白用不同的抗淬灭剂将 FITC 标记的微球封片，
100 瓦贡弧灯照射 30 秒，40x/1.3 NA 油镜观察，
12-bit 单色 CCD 成像。取20 个微球的平均荧光强度作图。

ProLong® Gold 和 SlowFade® Gold 的抗淬灭效果：（以 40X/1.3 NA 物镜 100 瓦贡弧灯连续照射 30 秒后，与初始荧光强度相比的百分率表示）

操作步骤：
抗淬灭剂适用于多数的固定样品，但由于含有甘油，不适于某些用途，如亲脂的膜染料 Dil。

1．1 预温试剂：
从冰箱中取出试剂，平衡至室温；不推荐使用其他的热源，这样会降低产品的稳定性。

1．2 加封片介质（抗淬灭剂）：
将切片上多余的液体去除，加 1 滴（或适量）抗淬灭剂，盖上盖玻片；样本固定在盖玻片上的，加1 滴抗淬灭剂于干净的玻片上，小心将盖玻片放到滴有淬灭剂的位置，避免产生气泡。

1．3准备观察：
用 ProLong 封片的，将玻片置于黑暗干燥处待其凝固，时间从几个小时到过夜，依样本的厚度和环境的相对湿度而不同。推荐凝固 24 小时。若需长期贮存，在凝固后将盖玻片的边缘封住，防止封片剂收缩使样品扭曲变形。封好后，将玻片竖直存放在有盖的玻片盒中，室温、4℃或≤-20℃保存，加入干燥剂。若需马上观察，用指甲油或热蜡固定盖玻片的一角防止移动，边缘保持干净便于凝固。凝固后再将边缘封好便于长期保存。

用 SlowFade 封片的，可立即观察。较厚的样品，要等到试剂完全渗透。必要时也可以用指甲油或热蜡固定盖玻片的一角后观察。

荧光显微镜的设置：
样本在抗淬灭剂干燥之前也可以观察，但二者接触的越久，抗淬灭的效果越好，尤其是 ProLong，其折射率也会有变化。减少在光下的暴露时间，用中等强度的滤光片，仅在观察和记录图像时光照。保证好的成像效果，拍照时用最小光学、最高数字的光圈，较低的放大倍数，高质量的光学滤片，高速胶片和高效的镜头。

另外，ProLong® Gold 和 SlowFade® Gold 抗淬灭剂还有含 DAPI 的型式，减少了复染 DNA 的步骤。

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