流式三要素之一|样本篇

做流式实验需要仪器、样本以及试剂,对于流式实验而言,样本质量的高低对最终的检测结果有很大的影响。进行流式实验的样本多为外周血、骨髓、各类体液(如脑脊液、胸水、腹水)以及人体的组织(如淋巴结、脾、肝等)。不同的样本处理方法不同,想要获得好的检测结果,样本的制备和保存很关键。

本文就为大家分享各种样本的详细处理方法。


1.外周血/骨髓

样本保存:

收集样本后置于加有抗凝剂(一般选择肝素或EDTA)的试管中,室温保存,尽量在12 h内处理样本;若无法及时处理,4℃保存,此时最好选择肝素抗凝管。

样本制备:

一般不需要特殊处理制备单细胞悬液,所用试剂为淋巴细胞分离液和红细胞裂解液。但在临床检测中,为了避免细胞成分丢失,通常不推荐使用淋巴细胞分离液分离单核细胞。

抗凝剂的选择

血液标本可以使用EDTA、ACD(枸橼酸葡萄糖)或肝素抗凝。ACD和肝素抗凝的样本72 h内细胞是稳定的;EDTA抗凝48 h内是稳定的。

EDTA适用于白细胞的免疫表型分析,可防止成熟的髓系细胞贴壁造成细胞损失,并具有较强的抗血小板凝集能力,但对细胞活性的保持不如肝素抗凝。同时EDTA是二价阳离子的强螯合剂,会影响与Ca2+相关的抗原位点(如CD11b等),并会抑制与Ca2+相关的细胞功能。肝素常用于白细胞功能研究,可维持Ca2+和Mg2+在细胞内的生理浓度,更好保持细胞活性,适用于放置时间较长、不能及时检测的样本,但不适合血小板的相关检测。

骨髓样本优先选择肝素抗凝。


2.体液(如脑脊液、胸水、腹水)

样本保存:

收集样本后置于肝素抗凝管中,室温保存,且尽量在12 h内处理样本。若无法及时处理,则4℃保存,时间最好不超过48 h。

样本制备:

样本1000-1500 rpm离心5 min,弃去上清;

加入含有0.1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS),离心洗涤5 min;

加入适量PBS重悬。如有细小沉淀,用300目尼龙网过滤后备用。


3.组织(如淋巴结、脾、肝等)

样本保存:

切取新鲜组织样本置于生理盐水或PBS中,室温保存,尽量在12 h内处理样本;若无法及时处理,4℃保存,保存时间最好不要超过48 h。不建议用甲醛、乙醇固定细胞,不要用酶、表面活性剂处理细胞。

样本制备:

常用的组织样本制备单细胞悬液方法有:机械法、酶处理法、化学试剂处理法及表面活性剂处理法,在流式分析中,为保持抗原活性,多采用机械法处理样本。采用机械法需注意动作轻柔,尽量减少细胞的损伤。

若实验室无单细胞制备仪,手工剪切制备单细胞悬液:

PBS清洗组织样本,去除大量红细胞;

用眼科剪将组织剪成极小块,再次PBS清洗;

组织小块加入匀浆器中,加少量PBS匀浆;

用细注射针头抽取细胞悬液;

300目尼龙网过滤;

加入含0.1%牛血清白蛋白的PBS;

1000-1500 rpm离心5 min,弃去上清;

加入适量PBS重悬。