单细胞悬液制备
1. 细胞
材料：
消化酶、流式染色缓冲液（推荐目录号S1001）、流式管
操作过程：
- 悬浮细胞：离心收集细胞，去除上清，用流式染色缓冲液重悬细胞，达到细胞终浓度为2x105-106/mL。
- 贴壁细胞：用合适的酶消化细胞，（推荐）加入含血清的PBS或者含血清的细胞培养基终止蛋白酶反应，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，防止酶破坏细胞抗原表位，推荐Accutase酶消化细胞，减小细胞损伤（推荐目录号AT001）。然后离心收集，用流式染色缓冲液重悬细胞，达到细胞终浓度为2x105-106/mL。
2. 组织制备
- 使用酶消化或者研磨法从组织中得到细胞。
- 用300目尼龙滤网过滤。
- 离心细胞，去除上清，用流式染色溶液重悬细胞至合适浓度。
3. 全血
无需处理，流式管中加入100 uL全血（大概106个细胞）
胞外染色
注意要点
- 抗体拿到后瞬离。
- 抗体4℃避光保存，不要冻融。
- 染色后固定和延后分析将会导致信噪比降低。
实验过程：
针对需要裂红的单细胞悬液（例如脾脏，使用不含固定剂红细胞裂解液，溶血后再标记）
- 得到单细胞悬液，使用红细胞裂解液裂解红细胞5-10分钟，具体用量和操作可以参照说明书。
- 离心去除上清，100uL流式缓冲液重悬使细胞密度达到2x107/mL。
- 细胞表面抗体标记。做好对照，在冰上或者4度孵育20分钟，也可以在常温下孵育15分钟（具体温度和时间参考抗体说明书）。
- 加入流式染色缓冲液，1200转离心5分钟，去上清。
- 重复步骤4，再次洗涤去上清。
- 加入流式染色缓冲液500 uL重悬细胞，上流式检测。 （如果是生物素化或亲和纯化抗体，需要合适荧光二抗标记）
- 在溶液中加入二抗，在冰上或者4度孵育15-30分钟。
- 重复步骤4两次洗涤细胞。
- 加入流式染色溶液500 uL重悬细胞，上流式检测。
针对需要裂红的单细胞悬液（例如脾脏，使用含有固定剂红细胞裂解液，标记后再裂解，固定操作会影响细胞表面的marker）
- 得到单细胞悬液，细胞表面抗体标记。做好对照，在冰上或者4度孵育20分钟，也可以在常温下孵育15分钟（具体时间根据抗体说明书）。
- 使用红细胞裂解液裂解红细胞5-10分钟，具体用量和操作可以参照说明书。（注意观察颜色、浑浊度变化）
- 离心去除上清，500 uL重悬细胞，上流式检测。
胞内染色
注：视试剂盒不同，操作步骤有略微更改，BD的固定破膜剂，就需要裂解红细胞，而caltag的破膜剂，带有裂解红细胞作用。
- 制备单细胞悬液、细胞表面染色。
- 最后一次洗涤之后，加入固定溶液固定细胞，涡旋，避光孵育10-20分钟。
- 加入适量1 ml-3 ml缓冲液，离心5分钟，去除上清。
- 重复步骤3。（使洗涤更加充分，防止固定溶液影响后面破膜效果）
- 加入破膜溶液。
- 不同点--有的试剂盒，抗体可以跟破膜溶液同时孵育，避光孵育抗体10-20分钟。
- 加入适量1 ml-3 ml缓冲液，离心5分钟，去除上清。
- 用流式染色液重悬细胞，上机检测。
