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作者：联科生物 发布日期：2015-09-24 09:00
 Fluo-3AM的原理：FLUO-3广泛用于长波长的荧光钙指示剂。其在506NM处被吸收，可以被氩离子激光的488nm激发光激发，便于检测。FLUO-3在没有同钙结合的情况下，无荧光产生。但是，在与钙结合后，荧光（526nm）增强至少40倍。Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。Fluo-3 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525-530nm。 流式操作的推荐步骤： 1、收集细胞，重悬到106个细胞。 2、（可选步骤）加入丙磺舒，使终浓度达到1-2.5 mM或苯磺唑酮，终浓度为0.1–0.25 mM。（丙磺舒可提高细胞染色效率，减少Fluo-3 AM外漏）。 3、加入Fluo-3 AM，使终浓度为0.5-5 μM（具体浓度需要自己优化），20-37℃孵育15-60分钟。 4、用细胞染色缓冲液洗涤细胞三次，加入500 ul染色缓冲液，37℃ 条件下孵育 20-30 min，确保Fluo-3 AM在细胞内完全转变成Fluo-3。但需注意此时如放37C时间较长会增加fluo3从细胞的流失。 5、Fluo-3 AM的激发波长为488nm，发射波长为525nm。 首先收集样品大约1分钟，此时可以调节FL1电压使Fluo3基线信号在50左右或者以下。 然后软件上不中止样品的收集，但是迅速把样品管取出，往管中加 入ionomycin，混匀，然后放入采集处继续采集数据大约5分钟。此时应看到信号很快大幅度上升。 附件中图片是这个流式采集应该的样子，可以只看最左边的正对照。注意该文中FL1用的虽然是对数，但是线性的话图看起来会更好些。 相关产品信息：
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注意，为了去除流式仪器中残存的ionomycin或其他刺激物（以免引起下一个样品的误差），样品间最好用漂白水洗一下机子。
