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流式细胞术是一种基于检测设备-流式细胞仪，对悬浮的单个活细胞或颗粒进行快速、多参数检测分析的一项生物学前沿技术。自20世纪60年代后期发展起来后，已在生物医学领域得到了广泛的应用，免疫相关的科研实验室流式检测已成为不可或缺的研究手段，而临床的流式则成为了自基因诊断技术以来又一崭新的高技术检测方法。
那么为了得到一个真实可靠、准确灵敏的实验结果，都有哪些必然的要素呢？我们把这些影响最大的因素归纳为流式细胞术实验的三大要素，分别为：流式试剂的搭配、检测样本的制备、流式仪器的应用。今天带大家来认识下这三位流式界的好朋友。
手牵手之—|荧光标记抗体的搭配
在流式细胞术的免疫分型检测中，有各种荧光素偶联的抗体需要进行选择，特别是对于多色实验来说，对荧光素的选择搭配有着很高的要求，搭配效果直接影响到检测效果，那么我们根据什么来进行选择呢？
首要硬性条件-流式细胞仪的配置，流式细胞仪的激光器和滤光片配置决定了我们可以选择的偶联荧光标记的种类与数目。
目标蛋白条件-染料的亮度与抗原表达量相适应，目标蛋白的表达水平或丰度决定了荧光素的搭配。低表达的抗原，推荐搭配高亮度荧光素；高表达的抗原，推荐搭配低亮度荧光素。
荧光素条件-荧光素之间的光谱重叠最小化，我们需要尽量选择光谱重叠小的荧光素组合，光谱重叠严重的荧光素同时检测会导致荧光溢漏，干扰检测结果，需调节补偿后才能进行准确分析；还可优先选择不同激光激发的荧光素组合，如FITC搭配APC、PE搭配APC。
手牵手之二|检测样本的制备
对于流式细胞分析而言，制备的样本质量的高低对最终的检测结果有很大的影响。如在免疫学和血液学中我们常遇到的以下样本：外周血、骨髓、各类体液（如脑脊液、胸水、腹水）以及人体的组织（如淋巴结、脾、肝等），这些样本的不同处理制备和保存方法极为关键。如何进行保存更制备会更有利于流式检测呢？
联科为大家解惑喽！
外周血/骨髓-样本制备与保存：采用抗凝采血管，一般采用肝素纳或EDTA抗凝采血管，12h内检测建议室温保存，24h-48h处理则建议4℃保存，若需保存一周以上则建议使用淋巴细胞分离液分离出PBMC后进行冻存，待需要时再复苏检测。
体液（如脑脊液、胸水、腹水）-样本制备与保存：采用肝素钠抗凝管采集，收集后需要对样本进行离心，并加入适量的staining buffer进行洗涤、重悬，12h内检测建议室温保存，24h-48h处理则建议4℃保存，如有细小沉淀，上机前建议采用300目尼龙网过滤再进行检测。
组织（如淋巴结、脾脏、肝脏）-样本制备与保存：切取新鲜组织样本置于生理盐水或PBS中，采用机械法、酶处理法等方式将细胞轻柔的处理成单细胞悬液，尽量减少细胞损伤，12h内检测建议室温保存，24h-48h处理则建议4℃保存，上机前建议采用300目尼龙网过滤再进行检测。过程中不要用甲醛、乙醇、表面活性剂等直接处理组织或单细胞样本哦，咱得根据不同的实验目的，具体问题具体解决滴！
手牵手之三|检测仪器的选择
用于流式细胞术的仪器在过去的几十年里不断“进化”着，以满足越来越多的科研与临床应用需求，细胞群可以根据其荧光或散射光的特性进行分析或分选。以下是市面上常见的几款流式细胞仪-分析仪、分选仪：
市面上如此多种型号的流式细胞仪，但其基本结构大同小异，我们主要围绕流式分析仪来展开讲解，分析型的流式细胞仪主要由液流系统、光路系统、检测分析系统来组成。
液流系统-主要由鞘液构成：在一定压力下，鞘液将细胞或颗粒聚焦在一条直线，并将其输送到激光拦截点。
光路系统-由激光器和光电倍增管组成，产生用于分析样品的散射光和荧光信号。根据发射波长可以将激光器分为常见的488nm的蓝激光器、635nm的红激光器和405nm的紫激光器等，不同的激光器发出的激光照射到细胞后产生的英光信号被引导到特定的探测器，经光电倍增管转化为电子信号。同时接收的光信号也包括散射光信号，即反映细胞大小的前向散射光（FSC），以及反映细胞复杂程度的侧向散射光（SSC）。
需注意的是一个激光器下可以有多个荧光通道，一个通道对应多个荧光染料，以APC通道为例，可以同时接收APC、Alexa Fluor647、eFluor660荧光信号，因此原则上这3种荧光素不能同时检测同一个样本的不同指标，否则将无法分析该通道上的信号是来自于哪种荧光素。
监测分析系统-以通道为单位，将各个通道探测器收集的光信号进行分析、汇总，并转换成可以被计算读取的数字信号，最后得出样本的物理学特征以及特定蛋白表达的生物学特征。
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