流式非特异性荧光的照妖镜-同型对照

什么是同型对照

同型对照是指与检测抗体相同种属来源、相同亚型、相同荧光标记，但对目标靶点没有特异性结合的抗体。它能让非特异性荧光现原形，从而得到真正的阳性目的细胞群。

同型对照的作用

衡量抗体与抗原的非特异性结合造成的背景染色情况。

为何需要同型对照

我们都知道抗体是由Fab和Fc构成的（Y字型），其中Fab端是可变区域，能与抗原特异性结合，而Fc端是恒定的，它可以和我们表达Fc受体的细胞非特异结合，免疫细胞（除了T细胞）表面大多表达Fc受体，其中以单核细胞、巨噬细胞尤甚，这就意味着我们检测出来的阳性不仅包括目标细胞，还包括了表达Fc受体的非目的细胞，为了识别检测结果中的非目的细胞群，我们可以使用同型对照。

如何选择合适的同型对照？

1.基本原则

同型对照一般选择与一抗完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体。例如一抗是抗人的CD4-FITC抗体，来源种属是Mouse ，亚型和亚链是IgG2a, κ, 那么它的同型对照应该是FITC标记的Mouse IgG2a,κ。一抗的种属来源、亚型和亚链、荧光标记信息可在产品说明书中找到，如截图中的产品

2.特殊原则

如果是抗体的组合形式是纯化的一抗＋荧光标记的二抗，那么应该选择一抗的同型对照。

3.次要原则

如果找不到完全相同的同型对照，在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下，再按照亚链不同－－亚型不同－－相同类别的顺序选择。

同型对照应用场景

1.可不用同型对照的场景

流式图分群清晰明显可不使用同型对照，如CD3、CD4、CD8等指标，此时可根据阴性细胞的显著分群进行设门

2.可考虑使用同型对照的情况

- 做胞内流式实验，比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等

- 检测表面标志特异性不高或者不常见的指标，如多抗，非特异性结合非常多，使用同型对照可排除假阳性

- 不熟悉不常见标志的表达情况，根据同型对照可以判断阳性细胞的位置

- 如果样本中存在死细胞，由于死细胞的非特异性染色较强，故需要使用同型对照与死活染料共同来判断假阳性细胞

同型对照实验Q&A

1. 同型对照比阴性细胞荧光强，会是什么原因呢？
建议从以下几个方面进行排查
- 检查同型对照选择是否选择正确
- 需要对目标抗体进行滴定，因为浓度饱和会造成阴性峰的偏移和基底增宽。确保同型对照使用浓度和滴定后的一抗保持一致
- 同型对照一定要用细胞，而且和实验样本保持一致
- 因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而跟其类似的抗原非常多，那么加入同型对照时，同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象，这时候可添加商品化的Fc阻断剂来进一步阻断。如联科的Anti-Mouse CD16/CD32, Purified (Clone:2.4G2)功能抗体（货号：F210163200），在流式检测中，可对细胞表面的Fc受体进行封闭，减少非特异性结合。

2.如果实验中同时染多个抗体会用到了多种荧光素，在进行分析时，荧光渗漏对结果的影响较为明显，同型对照无法反映出其它通道渗漏的荧光背景，该怎么办？

建议通过联合使用同型对照与FMO对照，来消除荧光溢漏和非特异性结合造成的影响。

3.同型对照的用量怎么确定？

一般需要与染色的单克隆抗体相同剂量和浓度，或者咨询试剂厂家推荐的用量。

希望通过本文的介绍大家对同型对照有个初步的了解，如何有其他想要了解的地方，欢迎在评论区给小科留言。

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